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1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過實(shí)驗(yàn)了解熒光原位雜交技術(shù)的基本原理和在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。掌握原位雜交技術(shù)的操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。

2. 實(shí)驗(yàn)原理

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

雜交所用的探針大致可以分為三類：1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如a衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物系標(biāo)記的dUTP(biotin-dUTP)經(jīng)過缺口平移法進(jìn)行標(biāo)記，雜交之后用藕聯(lián)的熒光素的抗生物系的抗體進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用幾輪抗生物素蛋白?熒光素、生物素化的抗?抗生物素蛋白、抗生物素蛋白?熒光素的處理，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。

3. 實(shí)驗(yàn)用具及材料

Y染色體探針、人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。

4. 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1）探針及標(biāo)本的變性

（1）探針變性

將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

（2）標(biāo)本變性

①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。

③立即按順序?qū)��?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。

2）雜交

將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。

3）洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

（1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。

（3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。

（4）在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。

4）雜交信號(hào)的放大

（1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

（2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。

（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。

（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。

（5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。

（6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。

（7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。

5）封片

可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。

6）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針的探針?biāo)�在位置發(fā)出綠色熒光。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標(biāo)本的雜交中呈陽性，即使在末分裂的細(xì)胞中，也可以觀察到明顯的雜交信號(hào)。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖16-1）。

附錄I FISH相關(guān)溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl, 882.g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調(diào)pH至7.0）。

2）去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatmanl號(hào)濾紙過濾。

3）體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6）雜交液：8mL體積分?jǐn)?shù)25%DS， 20mL 20×SSC混合。（或40mL體積分?jǐn)?shù)50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，與5mL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10% DS 2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50% DF。

7） PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100mg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使終濃度為2.5mg /mL。

Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1：9比例充分混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲(chǔ)存液，按體積比1:300,以antifade溶液稀釋成工作液。

9）封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。

10）封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL混合。

11）熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。

12）洗脫液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。

13）TE緩沖液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。

14）溶液I：25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。

15）溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。

16）溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。

17）LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH調(diào)pH值至7.0。

附錄II DNA探針的制備

質(zhì)粒DNA克隆的提取、純化和鑒定。

1）用接種環(huán)挑取一小塊-70℃凍存的轉(zhuǎn)化菌，接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈震蕩過夜。

2）將收集到的菌液3000r/min離心10min，棄掉上清液。

3）向菌體沉淀中加入溶液I300mL, 溶液II 350mL，混勻后將其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混勻，加酚和氯仿混合液（體積比為1：1）500mL 后充分混勻。

4）12000r/min離心10min。

5）取上清液，向其加入600mL異丙醇，充分混勻后以12000r/min離心15～30min，棄掉上清液。

6）用1500mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀2～3次，晾干。

7）用TE緩沖液溶解DNA沉淀。

8）加水至200mL，以Rnase A（終濃度200mg /mL）在50℃水浴中消化30min。

9）加入酚、氯仿和異丙醇（三者體積比25：24：1）溶液200mL混勻，12000r/min離心2min。

10）取上清液，再加入氯仿和異戊醇溶液（體積比為24：1）200mL混勻，12000r/min離心2min。

11）取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL體積分?jǐn)?shù)100%乙醇沉淀DNA。

12）可將上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min離心15min。

13）將沉淀用1.5mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇輕洗，自然晾干。

14）用TE緩沖液溶解DNA。

15）取1～2mL上述純化的DNA溶液，于8.0g/L瓊脂糖/TBE緩沖液凝膠電泳鑒定DNA并檢測(cè)濃度。

16）取1mg DNA，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶4～5單位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。

17）電泳觀察，根據(jù)酶切片段數(shù)量及大小，估計(jì)DNA克隆插入片段大小。

附錄III 探針的生物素標(biāo)記

探針的標(biāo)記可采用PCR或缺口平移法來制備，但多數(shù)情況下采用缺口平移法來制備。該過程包括以DNase I在DNA雙鏈上作用產(chǎn)生缺口并以此作為第二反應(yīng)步驟的作用赳噗，即大腸桿菌聚合酶I自缺口處進(jìn)行修補(bǔ)合成。在修補(bǔ)合成互補(bǔ)鏈時(shí)將生物素標(biāo)記的d-NTP摻入，從而復(fù)制出帶有生物素標(biāo)記的探針。本實(shí)驗(yàn)采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP標(biāo)記探針。標(biāo)記好的探針可以在-20℃下長(zhǎng)期保存。

總反映體積50mL， DNA 1mg,10×dNTP 5mL, 10×Enzyme Mix 5mL。

其中10×dNTP為：500mmol/L Tris?HCl(pH 7.8)

50mmol/L MgCl2

100mmol/Lβ-硫基乙醇

100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白

0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP

0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP

10×酶混合為：0.5units/mL DNA聚合酶I

0.075untis/mL Dnase I

50mmol/L Tris?HCl(pH 7.5)

5mmol/L醋酸鎂

1mmol/L β-硫基乙醇

0.1mmol/L苯甲基磺酰氟

體積分?jǐn)?shù)50%甘油

100mg /mL牛血清白蛋白

將上述混合液于16℃作用1h。用8.0g/L瓊脂糖/TBE緩沖液凝膠電檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)物。以DNA片段長(zhǎng)約300～500bp為宜。如片段較大，則應(yīng)加適量Dnase I繼續(xù)酶切，直至DNA片段長(zhǎng)度適中后，加5mL終止緩沖液（300mmol/L EDTA）終止反應(yīng)。用乙醇沉淀的方法將探針與非摻入的核苷酸分開。